EXTRACCIÓN DEL ADN DEL TOMATE

EXTRACCIÓN DEL ADN DEL TOMATE

1. INTRODUCCIÓN TEÓRICA

El ADN o ácido desoxirribonucleico, es un ácido nucleico presente en todos los seres vivos que contiene toda su información genética y las instrucciones para la síntesis de proteínas en el interior de las células.

En organismos eucariotas, la fibra de ADN se ubica en el interior de la membrana nuclear, mientras que en los procariotas se encuentra en medio del citoplasma, con pequeños fragmentos sueltos llamados plásmidos que aportan características ventajosas.

Cuando las células de los organismos pluricelulares se dividen es necesario hacer una copia idéntica del ADN para cada célula hija. La cadena de ADN se separa y se hace una copia complementaria de cada una de las dos partes, idéntica a la otra. En esta replicación no deben haber fallos, ya que si la correspondencia de las bases nitrogenadas (Adenina-Timina y Guanina-Citosina) se altera, se produce una mutación, que puede conducir a cambios en el organismo a causa de una síntesis errónea de proteínas.

Para sintetizar proteínas, se emplea el ARN, ácido ribonucleico, con la misma estructura del ADN pero con la pentosa ribosa en lugar de la desoxirribosa y la base nitrogenada uracilo en sustitución de la timina, también complementario a la adenina. El ARN mensajero hace una cadena complementaria de una de las hélices, para luego trasladarla a los ribosomas, donde el ARN transferente selecciona aminoácidos para conformar proteínas a partir de la información de las bases nitrogenadas. Por ello, si en el ADN del que se ha hecho la copia hay un error, los aminoácidos pueden ser mal seleccionados.

Cuando el ADN se ha replicado, en la división celular, este se enrolla alrededor de la proteína histona para formar cromosomas. En la especie humana, existen 23 pares de cromosomas. Cada par contiene la información que determina ciertos caracteres y está conformado por un cromosoma del padre y otro de la madre del individuo. Ya que cada cromosoma contiene la misma información duplicada, este presenta dos cromátidas antes de la división.

La división consta de una serie de fases. La profase, la condensación del ADN y rotura de la membrana nuclear; la metafase, la colocación de los cromosomas en el eje central de la célula; la anafase, la separación de las cromátidas de cada cromosoma estiradas por los hilos del huso acromático, que parte del centrosoma ; y la por último, telofase, la formación de las nuevas membranas nucleares y descondensación del ADN en cada célula hija .

Como técnica de laboratorio, con el fin de amplificar un fragmento de ADN, obteniendo millones de copias de este, y determinar cadenas genéticas, se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa o PCR. En agronomía, esta técnica se utiliza para determinar los individuos con mayor resistencia a plagas, para favorecer su reproducción y la perpetuación de estas características ventajosas, que son identificables gracias a trazas que aparecen en el ADN ampliado.

2. MATERIAL NECESARIO

- Hoja de tomatera (Solanum lycopersicum)                             - Papel de filtro

-  Pequeño mazo de plástico                                                           -  Tubos cónicos con tapa

- Pipeta automática con capacidad máxima de 200mL            -  Gradilla

-  Pipeta automática con capacidad máxima de 500mL           - Rotulador permanente

-  Puntas de plástico con forma cónica para cada pipeta          -  Centrifugadora

-  Incubadora                                                                                     -  Vaso de plástico (papelera)


 3. HIPÓTESIS INICIAL
Se someterá a la hoja de tomatera a procesos químicos y se obtendrá su ADN en
finas hebras translúcidas en suspensión en el agua.

4. OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

Conocer datos sobre el Ácido desoxirribonucleico.

Aprender acerca de la técnica de laboratorio PCR.

Manipular distintos tipos de compuestos químicos  con instrumental preciso.

Observar físicamente el ADN extraído.

Familiarizarse con el ambiente de trabajo de laboratorio.

5. MÉTODO DE EXPERIMENTACIÓN

1.  Se lavan las manos y se coloca el material necesario sobre el espacio de laboratorio.

2.   Se rotulan con los nombres los tubos cónicos con tapa vacíos.

3.  De una parte del tallo de tomatera se extrae una hoja (a poder ser de los brotes) y se introduce en el tubo cónico.

4.  Con la pipeta automática se extraen 250μl del tampón de extracción (formado por el Tris, EDTA y NaCl) y se vierten en el tubo cónico con la hoja de tomatera.

5.  Se tritura la hoja de tomatera con el mazo pequeño de plástico y se añade con la pipeta otros 250μl del tampón de extracción.

6.  Con la pipeta con capacidad máxima de 200μl se añaden 35μl de SDS al tubo cónico.

7.   Se cierra la tapa, se agita y se incuba a 65ºC en la incubadora durante 5min.

8.   Con la punta de la pipeta cambiada, se añaden 130μl de Acetato de potasio a la muestra y se incuba 5min a temperatura ambiente.

9.  Para purificar el ADN, se centrifuga la muestra a 13000rpm durante 10min. Cabe destacar que la cantidad de tubos cónicos debe ser igual en paralelo para evitar diferencias de peso.

10. Con la pipeta de 500μl con punta nueva se extrae el máximo posible del sobrenadante (en este se encuentra el ADN), evitando coger el precipitado.

11. Se vierte el sobrenadante en otro tubo cónico y se desecha el precipitado sobrante en el primer tubo.

12. Con una pipeta se echa 500μl de isopropanol en el tubo del sobrenadante y, con la otra, 60μl de Acetato de sodio.

13. Se incuba la muestra 10min a temperatura ambiente y se centrifuga a 12500rpm durante otros 10min.

14. Ya que el ADN ha precipitado, se elimina el sobrenadante.

15. Se añade con la pipeta 300μl de etanol al 70% a la muestra y se golpea ligeramente para la desadherencia del ADN de las paredes del tubo.

16. Se centrifuga durante 5min a 12500rpm.

17. Se limpia el espacio de trabajo.

Compuestos químicos utilizados para la extracción del ADN y sus funciones.

-Tampón de extracción: favorece la lisis de las células.

-  Tris(hidroximetilaminometano): mantiene el pH estable.

- EDTA (ácido etilendiaminotetraacético): inhibe las enzimas ADNasas, que pueden dañar el material genético.

- NaCl: al neutralizar la carga de los grupos fosfatos, insolubiliza el ADN en alcohol.

-  SDS (detergente): degrada el núcleo (ya que este es graso) para poder liberar el

                                  ADN.

- Acetato de potasio: favorece la precipitación de proteínas y de otros restos celulares, pero no del ADN.

-   Isopropanol: ya que el ADN ahora es insoluble en él, ayuda a que precipite.

-   Acetato de sodio: favorece la precipitación del ADN.

6. OBTENCIÓN DE RESULTADOS

ADN extraído en etanol

hoja de tomatera triturada y

 mezclada con TRIS

7.ANÁLISIS DE RESULTADOS 
El ADN se observa precipitado en el fondo del tubo cónico y presenta un área
aproximada de 1 mm2, una forma irregular y color marrón. Cabe destacar que la hoja de
la que se ha extraído tenía un área aproximada de 20mm2.

8. CONCLUSIONES
Tras someter una hoja de tomatera a procesos físico-químicos, se puede observar su ADN
precipitado que presenta 1/20 de su área y un color marrón.

9.ERRORES DE LA PRÁCTICA
No se usaron guantes ni bata.
Algunas de las cantidades extraídas y vertidas mediante la pipeta no fueron exactas, y
que accidentalmente se introdujeron burbujas de aire.
No se midió el peso de la hoja de tomatera de la que se extrajo el ADN.
Los tiempos no fueron exactos.
Falta de tiempo para desarrollar la práctica.

10. CONFIRMACIÓN O RECHAZO DE LA PRÁCTICA

El resultado dio una porción “compacta” de 1mm2 de material genético. De este modo, la
densidad del ADN extraído es mayor a la del etanol, por lo que el material genético
tiende a bajar, y no a estar en suspensión. La cantidad que se esperaba
obtener era aproximadamente la misma a la obtenida.