DESNATURALIZACIÓN DE LA AMILASA

DESNATURALIZACIÓN DE LA AMILASA

1. INTRODUCCIÓN TEÓRICA 

La amilasa es una enzima hidrolasa, es decir, es una enzima capaz de catalizar la hidrólisis de un enlace químico. Tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para formar azúcares simples. Se produce principalmente en las glándulas salivales y en el páncreas.  En los animales  la α-amilasa es una enzima digestiva. Esta es dependiente al calcio y completamente afuncionales en ausencia de iones de calcio. Actúan a lo largo de cualquier punto de la cadena de los carbohidratos, descomponiéndolos en dextrina desde la amilopectina. Esta enzima actúa en una serie de medios óptimos. Su acción se efectua mejor a un pH cercano a neutro, en una cierta concentración y a una temperatura de 37ºC. Por esto variar la temperatura, el pH o la concentración supondría su desnaturalización, es decir, la pérdida de la actividad enzimática.

* IMAGEN: Amilasa salival humana. Un ion calcio es

  visible en color amarillo y un ion cloruro en verde.

En esta práctica será necesaria la utilización de Lugol para comprobar la presencia de almidón, ya que esta reacciona con el almidón produciendo un color púrpura profundo.Esta reacción es el resultado de la formación de cadenas de Poliyoduro a partir de la reacción del almidón con el yodo presente en la solución de un reactivo llamado Lugol. Se trata de una disolución de yodo molecular (I2) y yoduro potásico (KI) en agua destilada. 

También haremos uso de Fehling A y B para detectar azúcares reductores. Estos reactivos sirven para detectar la presencia de glucosa y derivados de esta, como la sacarosa o la fructosa. Este se oxida a ácido y reduce la sal de cobre en medio alcalino de los azucares reductores, a óxido de cobre, formando un precipitado de color rojo.

2. MATERIAL NECESARIO

-Saliva humana                                                  - Almidón

- Ácido cítrico                                                     - Ácido acético

- Bicarbonato sódico                                         - Cloruro sódico

- Agua                                                                  - Bolsa de hielo

- Hornillo de laboratorio                                  - Vaso de precipitado

- Vidrio reloj                                                       - 11 tubos de laboratorio

- Cuchara de laboratorio                                  - Rotulador permanente

- Gradilla                                                              - Báscula

- Pipetas con capacidad de 5mL y 10mL        - Propipeta

- Pipeta Pasteur                                                  - Pinza de laboratorio

- Lugol                                                                   - Reactivo de Fehling A y B                       

- Pocillo

                

3.HIPÓTESIS INICIAL
 La enzima amilasa de la saliva (disuelta en agua) degradará el almidón (también disuelto en agua), haciendo que de este sólo queden moléculas de glucosa sueltas, con las que reaccionará el reactivo de Fehling A y B, provocando que en la disolución se produzcan cambios físicos. No obstante, si se desnaturalizan las proteínas de la amilasa mediante cambios bruscos de temperatura, en la acidez o en la salinidad, el almidón no se somete a la lisis enzimática, quedando íntegro. Por ello, con esa disolución reaccionará el lugol, produciendo también cambios físicos.


4. OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA

Aprender sobre las reacciones del Lugol con el almidón y el reactivo de Fehling con la glucosa.Descubrir cómo la amilasa degrada el almidón y qué pasa si esta se desnaturaliza.Manejar instrumental de laboratorio con precisión.Trabajar con diversos productos químicos y disoluciones para las desnaturalizaciones.Observar los resultados para sacar conclusiones sobre las desnaturalizaciones a partir de las reacciones.

5. MÉTODO DE EXPERIMENTACIÓN

1. Se lavan las manos, se colocan los guantes y la bata y se prepara el material.

2. Se disuelve saliva con agua, pipeteando 1mL en el tubo 1 y 2,2’,3,3’,4,4’,5 y 5’ y 0,5mL en los tubos 6 y6’.

3. Se prepara una disolución de bicarbonato sódico en agua al 30% y se pipetea 1mL de esta a cada uno de los tubos 3 y 3’, además de 1mL de ácido cítrico.

4. Se añade 0,5g de NaCl a los tubos 4 y 4’.

5. Los tubos 5 y 5’ se someten a cambios en la temperatura, pasando de un medio frío (bolsa con hielo durante 2 minutos) a un medio caliente (baño María a 37ºC durante 1 minuto).

6. Se añade 0,5mL de ácido acético a los tubos 6 y 6’.

7. Midiendo con la báscula, se vierte 0,75g de almidón en un vidrio reloj y se mezclan con 15mL de agua, dando lugar a una disolución de almidón al 10%.

8. Se vierte 1mL de la disolución de almidón en cada uno de los tubos, calentando a 37ºC el 1, 2 y 2’ (el primero al baño María) durante 3 minutos.

9. Se vierte en los tubos 2,3,4,5 y 6 1mL de yodo Lugol (en el 1 0'2mL) y en los tubos 1’,2’,3’,4’,5’ y 6’0,5mL de Fehling A y 0,5mL de Fehling B.

10. Se calientan los tubos durante 1min al baño María para acelerar la reacción.

11. Se observan los resultados y se extraen conclusiones.

6. OBTENCIÓN DE RESULTADOS

Tubo 1 después de la reacción Lugol-Almidón

Tubos 2-6 después de la reacción con Lugol

Estado incial de los tubos 2'-6' con reactivo de Fehling A y B

Estado final de los tubos 2'-6' después de 1min al baño María

6. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Podemos afirmar que el lugol al reaccionar con el almidón da lugar a un color morado (marrón oscuro si la reacción no se ha completado). Por su parte, la mezcla de Fehling A y B da lugar a un color amarillo (azul verdoso si la reacción no se ha completado).

Se pueden observar los siguientes resultados:

TUBO	CONTENIDO	REACCIÓN	COLOR
1	1mL Almidón en H2O 10%	Lugol (1mL)	Morado
2	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O	Lugol (1mL)	Marrón Translúcido
2’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Azul verdoso
3	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 0,5mL ácido cítrico 0,5mL NaCO3 en H2O 30%	Lugol (1mL)	Morado – Marrón oscuro
3’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 1mL ácido cítrico 1mL NaCO3 en H2O 30%	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Amarillo
4	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 0’5g NaCl	Lugol (1mL)	Marrón transparente
4’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O 0,5g NaCl	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Azul verdoso
5	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O Cambios bruscos en temperatura	Lugol (1mL)	Marrón transparente
5’	1mL Almidón en H2O 10% 1mL saliva disuelta en H2O Cambios bruscos de temperatura	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Marrón translúcido
6	1mL Almidón en H2O 10% 0’5mL saliva disuelta en H2O 0’5mL ácido acético	Lugol (1mL)	Morado
6’	1mL Almidón en H2O 10% 0’5mL saliva disuelta en H2O 0’5mL ácido acético	Fehling A y B (0,5mL de cada)	Azul

Destacar que los colores en los tubos’ (excepto el 3’) al reaccionar con los reactivos de Fehling A y B eran inicialmente azules, pero al acelerar la reacción mediante 1 minuto al baño María (37ºC) los colores tendieron a verde (excepto el 6’).

Se pueden observar los siguientes resultados.

Tubo 1: El lugol reacciona con el almidón, al no haber estado hidrolizado.

Tubo 2 y 2’: El almidón está hidrolizado al no presentar desnaturalizaciones la amilasa, por eso el Fehling tiene tendencia a reaccionar y el lugol no.

Tubo 3 y 3’: Ambos tubos presentan reacciones: lugol con almidón y Fehling con glucosa, por lo que se concluye que parte del almidón ha sido hidrolizado y parte no (al no haber sido completamente desnaturalizada la amilasa).

Tubo 4 y 4’: La amilasa no ha sido desnaturalizada, por lo que ha degradado el almidón. Por ello reacciona el Fehling y el lugol no.

Tubo 5 y 5’: La amilasa no ha sido desnaturalizada, por lo que ha degradado el almidón. Por ello reacciona el Fehling y el lugol no.

Tubo 6 y 6’: La amilasa ha sido correctamente desnaturalizada, por lo que el almidón no se ha degradado. El lugol reacciona y el Fehling no.

Las posibles causas de las desnaturalizaciones fallidas aparecen en el apartado 9)Errores de la práctica.

8. CONCLUSIONES

El ácido acético es capaz de desnaturalizar la amilasa salival para que esta no degrade el almidón.

El lugol produce una reacción al detectar el almidón, volviéndose de color morado; al contrario que el reactivo de Fehling A y B, que reaccionan con la glucosa, tornándose de color amarillento.

La amilasa es una enzima que degrada el almidón, rompiendo los enlaces glucosídicos y separándolo en moléculas sueltas de glucosa.

9.ERRORES DE LA PRÁCTICA

Los fallos en la desnaturalización de las proteínas de la amilasa se pueden producir a las siguientes causas:

-          Desde las desnaturalizaciones hasta las reacciones finales pasaron dos semanas.

-          En los tubos 3 y 3’, aparte del vaso de precipitado inicial con la disolución de almidón, aparecieron hongos a causa del incorrecto aislamiento.

Aunque se intentó precisión mediante báscula y pipetas, algunas medidas no fueron del todo exactas y hubo errores en ellas.

No se utilizaron las medidas de seguridad e higiene pertinentes en todo momento.

10. CONFIRMACIÓN O RECHAZO DE LA HIPÓTESIS

La enzima amilasa de la saliva efectivamente degrada el almidón, haciendo que las moléculas de glucosa queden sueltas, por lo que el reactivo de Fehling A y B reacciona, quedando un fluido de color amarillento. Si se desnaturalizan correctamente las proteínas de la amilasa (de forma segura mediante ácido acético), el almidón no se hidroliza, por lo que efectivamente reacciona con el lugol él, de forma que se queda un fluido morado.